如果將細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)在同一個(gè)容器中，培養(yǎng)密度會(huì)逐漸增大，造成細(xì)胞衰老、細(xì)胞死亡。為了防止這種情況，將少量細(xì)胞移植到單獨(dú)的容器中，這個(gè)過(guò)程稱為“傳代”。

傳代程序根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)而略有不同，因此請(qǐng)務(wù)必檢查適合您所處理的細(xì)胞的方法。在本文中，我們將解釋三種細(xì)胞的傳代程序：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞傳代

貼壁細(xì)胞在體外生長(zhǎng)，直到培養(yǎng)容器表面被細(xì)胞覆蓋或培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡。最好在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到完全匯合之前進(jìn)行傳代。

所需設(shè)備和試劑：

1.預(yù)熱至37°C的完全培養(yǎng)基

2.70%乙醇

3.不含鈣鎂離子的PBS(-)

4.0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA）

5.胰蛋白酶抑制劑（可選）

6.臺(tái)盼藍(lán)

7.培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶和標(biāo)簽

8.倒置顯微鏡

9.離心機(jī)（可選，用于收集細(xì)胞）

10.血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

11.移液器

貼壁細(xì)胞傳代方法：

以下是以0.25%胰蛋白酶為例的貼壁細(xì)胞傳代步驟：

1.觀察細(xì)胞狀態(tài)：使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和匯合度。

2.移除舊培養(yǎng)基：小心吸出培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。

3.清洗細(xì)胞：用不含鈣鎂離子的PBS(-)清洗細(xì)胞，去除殘留的血清，以避免抑制胰蛋白酶活性。（根據(jù)細(xì)胞類型，此步驟可省略）

4.加入胰蛋白酶溶液：加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA，根據(jù)細(xì)胞類型決定），確保覆蓋細(xì)胞表面。

5.消化細(xì)胞：將培養(yǎng)容器置于37°C孵育器中消化，根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間，通常為1-5分鐘，并密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離瓶底時(shí)即可終止消化。

6.終止消化：加入含有血清的完全培養(yǎng)基或胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化作用。

7.制備細(xì)胞懸液：用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶底并形成均勻的細(xì)胞懸液。

8.計(jì)數(shù)細(xì)胞：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)。

9.稀釋和接種：根據(jù)所需的細(xì)胞密度，用新鮮的完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)容器中。

10.培養(yǎng)細(xì)胞：將新的培養(yǎng)容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進(jìn)行培養(yǎng)。

貼壁細(xì)胞傳代技巧

執(zhí)行此操作時(shí)需要記住幾點(diǎn)。首先，根據(jù)生長(zhǎng)階段，某些細(xì)胞系可能與表面的附著較弱，容易脫落。經(jīng)常檢查培養(yǎng)容器內(nèi)部的狀況，注意不要過(guò)早地分離細(xì)胞。

在步驟3中，用PBS(-)沖洗細(xì)胞表面，去除培養(yǎng)基中的血清。這很重要，因?yàn)橐鹊鞍酌冈谘宕嬖谙虏换钴S。

當(dāng)使用胰蛋白酶/EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，請(qǐng)以分離細(xì)胞所需的最短時(shí)間進(jìn)行處理。長(zhǎng)時(shí)間接觸可能會(huì)損害細(xì)胞表面受體。還可以使用非酶細(xì)胞分離劑（例如胰蛋白酶）來(lái)分離細(xì)胞。建議根據(jù)需要使用，例如當(dāng)您想在溫和的條件下剝皮時(shí)。

當(dāng)將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)容器中時(shí)，必須用血清中和胰蛋白酶以使細(xì)胞粘附。除了使用血清外，還可以使用胰蛋白酶抑制劑（例如來(lái)自大豆的抑制劑）來(lái)中和胰蛋白酶。在這種情況下，首先向要中和的懸浮液中添加等體積的胰蛋白酶抑制劑（濃度為1mg/mL）。然后將添加的溶液離心，棄去上清液，并將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。此程序在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)特別有效。

如果沒(méi)有二氧化碳培養(yǎng)箱，則用經(jīng)過(guò)0.2μm過(guò)濾器消毒的空氣中的5%二氧化碳交換氣體1-2分鐘。

如果細(xì)胞密度不夠，則以150×g離心5分鐘，并用少量培養(yǎng)基重新懸浮。

懸浮細(xì)胞傳代

懸浮細(xì)胞通常來(lái)源于血細(xì)胞或可以在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。它們可以以單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊的形式生長(zhǎng)。懸浮細(xì)胞的傳代通常比貼壁細(xì)胞更容易。

所需設(shè)備和試劑：

1.預(yù)熱至37°C的完全培養(yǎng)基

2.70%乙醇（用于消毒）

3.臺(tái)盼藍(lán)

4.培養(yǎng)瓶和標(biāo)簽

5.倒置顯微鏡

6.吸管

7.血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

8.離心機(jī)(如果需要分散細(xì)胞)

9.條件培養(yǎng)基(可選):

條件培養(yǎng)基是指培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間后收集的培養(yǎng)上清液，其中可能含有細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子和其他活性物質(zhì)。對(duì)于某些細(xì)胞系，可以將少量條件培養(yǎng)基(例如10-20%)添加到新鮮培養(yǎng)基中，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，使用條件培養(yǎng)基需要謹(jǐn)慎，并根據(jù)具體細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化。

以下是懸浮細(xì)胞傳代的步驟：

1.檢查細(xì)胞狀態(tài):在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、密度和活力，并檢查是否存在污染。健康的懸浮細(xì)胞通常呈圓形、明亮且具有折光性。

2.分散細(xì)胞(如果需要):對(duì)于容易結(jié)團(tuán)的細(xì)胞，可以將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，以150xg離心5分鐘。棄去上清液，然后將細(xì)胞沉淀重懸于新鮮培養(yǎng)基中，并用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。對(duì)于不結(jié)團(tuán)的細(xì)胞，此步驟可以省略，直接進(jìn)行下一步。

3.計(jì)數(shù)細(xì)胞:取少量細(xì)胞懸液(100-200μL)，用臺(tái)盼藍(lán)染色，然后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)。

4.稀釋和接種:根據(jù)細(xì)胞類型和生長(zhǎng)速度，計(jì)算所需的細(xì)胞密度和培養(yǎng)基體積。使用新鮮的預(yù)熱完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至合適的濃度，然后將細(xì)胞懸液接種到新的、已標(biāo)記的培養(yǎng)容器中。

5.培養(yǎng)細(xì)胞:將新的培養(yǎng)容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進(jìn)行培養(yǎng)。

6.定期觀察和傳代:定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞密度和活力，確定合適的傳代時(shí)間和比例。

處理生長(zhǎng)過(guò)度的細(xì)胞:

如果細(xì)胞密度過(guò)高，培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化（例如，含酚紅的培養(yǎng)基變黃），或細(xì)胞活力下降，則表明細(xì)胞可能生長(zhǎng)過(guò)度。在這種情況下，建議降低接種密度，并更頻繁地更換培養(yǎng)基，而不是簡(jiǎn)單地添加條件培養(yǎng)基。對(duì)于某些細(xì)胞系，可以考慮使用條件培養(yǎng)基來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的恢復(fù)，但需要根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。

掌握細(xì)胞傳代技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本文詳細(xì)介紹了貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代的具體步驟、所需材料以及一些實(shí)用技巧。雖然我們提供了通用的指導(dǎo)原則，但不同細(xì)胞類型在最佳傳代時(shí)間、胰酶濃度、接種密度等方面存在差異。因此，在進(jìn)行細(xì)胞傳代操作前，務(wù)必查閱相關(guān)文獻(xiàn)和細(xì)胞系的具體說(shuō)明書(shū)，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。只有在實(shí)踐中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，才能更好地掌握細(xì)胞傳代技術(shù)，確保細(xì)胞的健康生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。希望本指南能夠幫助您在細(xì)胞培養(yǎng)的道路上更加得心應(yīng)手。