發(fā)布時間:2025-05-15 發(fā)布作者:上海通蔚生物
如果將細胞連續(xù)培養(yǎng)在同一個容器中,培養(yǎng)密度會逐漸增大,造成細胞衰老、細胞死亡。為了防止這種情況,將少量細胞移植到單獨的容器中,這個過程稱為“傳代”。
傳代程序根據(jù)細胞的性質(zhì)而略有不同,因此請務(wù)必檢查適合您所處理的細胞的方法。在本文中,我們將解釋三種細胞的傳代程序:貼壁細胞和懸浮細胞。
貼壁細胞在體外生長,直到培養(yǎng)容器表面被細胞覆蓋或培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡。最好在細胞生長達到完全匯合之前進行傳代。
所需設(shè)備和試劑:
1.預(yù)熱至37°C的完全培養(yǎng)基
2.70%乙醇
3.不含鈣鎂離子的PBS(-)
4.0.25%胰蛋白酶溶液(含或不含EDTA)
5.胰蛋白酶抑制劑(可選)
6.臺盼藍
7.培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶和標簽
8.倒置顯微鏡
9.離心機(可選,用于收集細胞)
10.血細胞計數(shù)器
11.移液器
貼壁細胞傳代方法:
以下是以0.25%胰蛋白酶為例的貼壁細胞傳代步驟:
1.觀察細胞狀態(tài):使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和匯合度。
2.移除舊培養(yǎng)基:小心吸出培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。
3.清洗細胞:用不含鈣鎂離子的PBS(-)清洗細胞,去除殘留的血清,以避免抑制胰蛋白酶活性。(根據(jù)細胞類型,此步驟可省略)
4.加入胰蛋白酶溶液:加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液(含或不含EDTA,根據(jù)細胞類型決定),確保覆蓋細胞表面。
5.消化細胞:將培養(yǎng)容器置于37°C孵育器中消化,根據(jù)細胞類型調(diào)整消化時間,通常為1-5分鐘,并密切觀察細胞形態(tài)變化,當細胞變圓并開始脫離瓶底時即可終止消化。
6.終止消化:加入含有血清的完全培養(yǎng)基或胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化作用。
7.制備細胞懸液:用吸管輕輕吹打細胞,使細胞完全脫離瓶底并形成均勻的細胞懸液。
8.計數(shù)細胞:使用血細胞計數(shù)器和臺盼藍染色進行細胞計數(shù)和活力檢測。
9.稀釋和接種:根據(jù)所需的細胞密度,用新鮮的完全培養(yǎng)基稀釋細胞懸液,并將細胞懸液接種到新的培養(yǎng)容器中。
10.培養(yǎng)細胞:將新的培養(yǎng)容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進行培養(yǎng)。
貼壁細胞傳代技巧
執(zhí)行此操作時需要記住幾點。首先,根據(jù)生長階段,某些細胞系可能與表面的附著較弱,容易脫落。經(jīng)常檢查培養(yǎng)容器內(nèi)部的狀況,注意不要過早地分離細胞。
在步驟3中,用PBS(-)沖洗細胞表面,去除培養(yǎng)基中的血清。這很重要,因為胰蛋白酶在血清存在下不活躍。
當使用胰蛋白酶/EDTA對細胞進行處理時,請以分離細胞所需的最短時間進行處理。長時間接觸可能會損害細胞表面受體。還可以使用非酶細胞分離劑(例如胰蛋白酶)來分離細胞。建議根據(jù)需要使用,例如當您想在溫和的條件下剝皮時。
當將細胞接種到新的培養(yǎng)容器中時,必須用血清中和胰蛋白酶以使細胞粘附。除了使用血清外,還可以使用胰蛋白酶抑制劑(例如來自大豆的抑制劑)來中和胰蛋白酶。在這種情況下,首先向要中和的懸浮液中添加等體積的胰蛋白酶抑制劑(濃度為1mg/mL)。然后將添加的溶液離心,棄去上清液,并將細胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。此程序在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時特別有效。
如果沒有二氧化碳培養(yǎng)箱,則用經(jīng)過0.2μm過濾器消毒的空氣中的5%二氧化碳交換氣體1-2分鐘。
如果細胞密度不夠,則以150×g離心5分鐘,并用少量培養(yǎng)基重新懸浮。
懸浮細胞通常來源于血細胞或可以在培養(yǎng)基中懸浮生長的細胞。它們可以以單細胞或細胞團塊的形式生長。懸浮細胞的傳代通常比貼壁細胞更容易。
所需設(shè)備和試劑:
1.預(yù)熱至37°C的完全培養(yǎng)基
2.70%乙醇(用于消毒)
3.臺盼藍
4.培養(yǎng)瓶和標簽
5.倒置顯微鏡
6.吸管
7.血細胞計數(shù)器
8.離心機(如果需要分散細胞)
9.條件培養(yǎng)基(可選):
條件培養(yǎng)基是指培養(yǎng)細胞一段時間后收集的培養(yǎng)上清液,其中可能含有細胞分泌的生長因子和其他活性物質(zhì)。對于某些細胞系,可以將少量條件培養(yǎng)基(例如10-20%)添加到新鮮培養(yǎng)基中,以促進細胞生長。但是,使用條件培養(yǎng)基需要謹慎,并根據(jù)具體細胞類型進行優(yōu)化。
以下是懸浮細胞傳代的步驟:
1.檢查細胞狀態(tài):在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、密度和活力,并檢查是否存在污染。健康的懸浮細胞通常呈圓形、明亮且具有折光性。
2.分散細胞(如果需要):對于容易結(jié)團的細胞,可以將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中,以150xg離心5分鐘。棄去上清液,然后將細胞沉淀重懸于新鮮培養(yǎng)基中,并用吸管輕輕吹打,使細胞分散成單細胞懸液。對于不結(jié)團的細胞,此步驟可以省略,直接進行下一步。
3.計數(shù)細胞:取少量細胞懸液(100-200μL),用臺盼藍染色,然后使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)和活力檢測。
4.稀釋和接種:根據(jù)細胞類型和生長速度,計算所需的細胞密度和培養(yǎng)基體積。使用新鮮的預(yù)熱完全培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至合適的濃度,然后將細胞懸液接種到新的、已標記的培養(yǎng)容器中。
5.培養(yǎng)細胞:將新的培養(yǎng)容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進行培養(yǎng)。
6.定期觀察和傳代:定期觀察細胞生長狀態(tài),根據(jù)細胞密度和活力,確定合適的傳代時間和比例。
處理生長過度的細胞:
如果細胞密度過高,培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化(例如,含酚紅的培養(yǎng)基變黃),或細胞活力下降,則表明細胞可能生長過度。在這種情況下,建議降低接種密度,并更頻繁地更換培養(yǎng)基,而不是簡單地添加條件培養(yǎng)基。對于某些細胞系,可以考慮使用條件培養(yǎng)基來促進細胞的恢復(fù),但需要根據(jù)具體情況進行調(diào)整。
掌握細胞傳代技術(shù)是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本文詳細介紹了貼壁細胞和懸浮細胞傳代的具體步驟、所需材料以及一些實用技巧。雖然我們提供了通用的指導(dǎo)原則,但不同細胞類型在最佳傳代時間、胰酶濃度、接種密度等方面存在差異。因此,在進行細胞傳代操作前,務(wù)必查閱相關(guān)文獻和細胞系的具體說明書,并根據(jù)實際情況進行優(yōu)化調(diào)整。只有在實踐中不斷積累經(jīng)驗,才能更好地掌握細胞傳代技術(shù),確保細胞的健康生長和實驗的順利進行。希望本指南能夠幫助您在細胞培養(yǎng)的道路上更加得心應(yīng)手。