發(fā)布時(shí)間:2025-05-19 發(fā)布作者:上海通蔚生物
早期的PCR技術(shù)雖然具有突破性意義,但也存在一些局限性,促使科研人員不斷努力開(kāi)發(fā)新的PCR酶和設(shè)備。本文主要圍繞酶發(fā)展史,介紹早期PCR存在的問(wèn)題,以及克服這些問(wèn)題的新型PCR酶的開(kāi)發(fā)。
最初,DNA聚合酶I的Klenow片段用于在PCR中擴(kuò)增DNA。然而,這種酶在高溫下不穩(wěn)定,在PCR每次循環(huán)的熱變性步驟中失去活性。此外,延伸反應(yīng)必須在低溫(+37°C)下進(jìn)行。由于這些原因,早期的PCR存在以下問(wèn)題并且不太方便:
對(duì)于實(shí)驗(yàn)者來(lái)說(shuō)非常繁瑣(每個(gè)循環(huán)添加Klenow酶是一項(xiàng)繁瑣且重復(fù)的任務(wù))
昂貴(由于使用了大量Klenow酶)
存在非特異性擴(kuò)增的可能性(在+37°C時(shí),引物與DNA的非目標(biāo)區(qū)域結(jié)合,擴(kuò)增非特異性區(qū)域)
此外,該技術(shù)每次添加新的酶時(shí)都需要打開(kāi)試管,容易受到污染;研究人員必須在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中保持在場(chǎng),這限制了他們一次可以處理的樣本數(shù)量;并且PCR過(guò)程無(wú)法輕易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
解決上述問(wèn)題需要很長(zhǎng)時(shí)間的研究。在此過(guò)程中,新的PCR酶和設(shè)備正在開(kāi)發(fā)中。下面我們就來(lái)看一下它的歷史。
科研人員對(duì)耐熱DNA聚合酶的分離和鑒定,使得通用PCR技術(shù)成為可能。TaqDNA聚合酶穩(wěn)定,在PCR所用的高溫(約+72°C)延伸反應(yīng)條件下表現(xiàn)出最佳活性。TaqDNA聚合酶在PCR重復(fù)循環(huán)過(guò)程中保持穩(wěn)定,因此無(wú)需在每次循環(huán)后停止PCR并添加更多酶(Saiki等人,1988)。
從那時(shí)起,人們進(jìn)行了各種改進(jìn),從而開(kāi)發(fā)出更準(zhǔn)確、更方便的PCR酶。
1989
DavidGelfand和SusanneStroffel(當(dāng)時(shí)在Cetus公司,后來(lái)在羅氏分子診斷公司)于1986年純化了天然Taq酶。勃林格曼(現(xiàn)為羅氏)是供應(yīng)重組Taq酶的公司之一。
然而,TaqDNA聚合酶仍有改進(jìn)的空間。首先,該酶缺乏校對(duì)活性,無(wú)法糾正擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤(潛在突變)。在大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)中,這些偶然發(fā)生的突變并不是什么大問(wèn)題。然而,對(duì)于某些應(yīng)用(例如擴(kuò)增基因組DNA以進(jìn)行測(cè)序或等位基因多態(tài)性研究),任何轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
具有校對(duì)活性的耐熱DNA聚合酶的發(fā)布解決了這個(gè)問(wèn)題,使得需要高度精確的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)高保真PCR。
1994
PwoDNA聚合酶是一種具有校對(duì)活性的耐熱酶,由勃林格曼公司(后來(lái)的羅氏公司)于1994年發(fā)布。
提高反應(yīng)保真度的另一種方法是將TaqDNA聚合酶與耐熱酶(例如,TgoDNA聚合酶)或其他具有校對(duì)活性的蛋白質(zhì)相結(jié)合。
1995
目前已有一款這樣的酶混合物——ExpandHighFidelityPCRSystem——上市。
使用酶混合物代替單一酶為PCR提供了重要的優(yōu)勢(shì),包括校對(duì)活性以及擴(kuò)增更長(zhǎng)靶標(biāo)的能力(Barnes,1994)。
1996
經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)以?xún)?yōu)化反應(yīng),發(fā)布了用于擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)20kb的目標(biāo)的酶混合物(擴(kuò)展長(zhǎng)模板PCR系統(tǒng),于1994年推出)。隨后,一種新的酶混合物被發(fā)布,它能夠擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)35kb的目標(biāo)(Expand20kbPLUSPCRSystem,于1996年推出)。
改良的TaqDNA聚合酶可實(shí)現(xiàn)“熱啟動(dòng)PCR”,該PCR在室溫下不活躍,但在DNA變性溫度下容易被激活(Birch等人,1996年)。這將最大限度地減少麻煩的引物二聚體的形成。
2000年,FastStartTaqDNA聚合酶
作為“熱啟動(dòng)PCR”應(yīng)用產(chǎn)品推出(2000)。通過(guò)在其酶混合物(FastStart高保真PCR系統(tǒng),于2003年推出)中添加FastStartTaqDNA聚合酶,羅氏創(chuàng)建了一個(gè)能夠滿(mǎn)足多重PCR和高保真熱啟動(dòng)PCR等苛刻應(yīng)用的系統(tǒng)。
以上我們介紹了PCR酶的發(fā)展和歷史。這樣發(fā)展起來(lái)的新型PCR技術(shù)現(xiàn)在不僅應(yīng)用于基礎(chǔ)研究,還應(yīng)用于醫(yī)療實(shí)踐、食品檢測(cè)和刑事調(diào)查等多個(gè)領(lǐng)域。