早期的PCR技術(shù)雖然具有突破性意義，但也存在一些局限性，促使科研人員不斷努力開發(fā)新的PCR酶和設(shè)備。本文主要圍繞酶發(fā)展史，介紹早期PCR存在的問(wèn)題，以及克服這些問(wèn)題的新型PCR酶的開發(fā)。

    早期PCR存在的問(wèn)題

    最初，DNA聚合酶I的Klenow片段用于在PCR中擴(kuò)增DNA。然而，這種酶在高溫下不穩(wěn)定，在PCR每次循環(huán)的熱變性步驟中失去活性。此外，延伸反應(yīng)必須在低溫（+37°C）下進(jìn)行。由于這些原因，早期的PCR存在以下問(wèn)題并且不太方便：

    對(duì)于實(shí)驗(yàn)者來(lái)說(shuō)非常繁瑣（每個(gè)循環(huán)添加Klenow酶是一項(xiàng)繁瑣且重復(fù)的任務(wù)）

    昂貴（由于使用了大量Klenow酶）

    存在非特異性擴(kuò)增的可能性（在+37°C時(shí)，引物與DNA的非目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，擴(kuò)增非特異性區(qū)域）

    此外，該技術(shù)每次添加新的酶時(shí)都需要打開試管，容易受到污染；研究人員必須在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中保持在場(chǎng)，這限制了他們一次可以處理的樣本數(shù)量；并且PCR過(guò)程無(wú)法輕易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

    解決上述問(wèn)題需要很長(zhǎng)時(shí)間的研究。在此過(guò)程中，新的PCR酶和設(shè)備正在開發(fā)中。下面我們就來(lái)看一下它的歷史。

    PCR酶發(fā)展史

    科研人員對(duì)耐熱DNA聚合酶的分離和鑒定，使得通用PCR技術(shù)成為可能。TaqDNA聚合酶穩(wěn)定，在PCR所用的高溫（約+72°C）延伸反應(yīng)條件下表現(xiàn)出最佳活性。TaqDNA聚合酶在PCR重復(fù)循環(huán)過(guò)程中保持穩(wěn)定，因此無(wú)需在每次循環(huán)后停止PCR并添加更多酶（Saiki等人，1988）。

    從那時(shí)起，人們進(jìn)行了各種改進(jìn)，從而開發(fā)出更準(zhǔn)確、更方便的PCR酶。

    1989

    DavidGelfand和SusanneStroffel（當(dāng)時(shí)在Cetus公司，后來(lái)在羅氏分子診斷公司）于1986年純化了天然Taq酶。勃林格曼（現(xiàn)為羅氏）是供應(yīng)重組Taq酶的公司之一。

    然而，TaqDNA聚合酶仍有改進(jìn)的空間。首先，該酶缺乏校對(duì)活性，無(wú)法糾正擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤（潛在突變）。在大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)中，這些偶然發(fā)生的突變并不是什么大問(wèn)題。然而，對(duì)于某些應(yīng)用（例如擴(kuò)增基因組DNA以進(jìn)行測(cè)序或等位基因多態(tài)性研究），任何轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

    具有校對(duì)活性的耐熱DNA聚合酶的發(fā)布解決了這個(gè)問(wèn)題，使得需要高度精確的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)高保真PCR。

    1994

    PwoDNA聚合酶是一種具有校對(duì)活性的耐熱酶，由勃林格曼公司（后來(lái)的羅氏公司）于1994年發(fā)布。

    提高反應(yīng)保真度的另一種方法是將TaqDNA聚合酶與耐熱酶（例如，TgoDNA聚合酶）或其他具有校對(duì)活性的蛋白質(zhì)相結(jié)合。

    1995

    目前已有一款這樣的酶混合物——ExpandHighFidelityPCRSystem——上市。

    使用酶混合物代替單一酶為PCR提供了重要的優(yōu)勢(shì)，包括校對(duì)活性以及擴(kuò)增更長(zhǎng)靶標(biāo)的能力（Barnes，1994）。

    1996

    經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)以優(yōu)化反應(yīng)，發(fā)布了用于擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)20kb的目標(biāo)的酶混合物（擴(kuò)展長(zhǎng)模板PCR系統(tǒng)，于1994年推出）。隨后，一種新的酶混合物被發(fā)布，它能夠擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)35kb的目標(biāo)（Expand20kbPLUSPCRSystem，于1996年推出）。

    改良的TaqDNA聚合酶可實(shí)現(xiàn)“熱啟動(dòng)PCR”，該PCR在室溫下不活躍，但在DNA變性溫度下容易被激活（Birch等人，1996年）。這將最大限度地減少麻煩的引物二聚體的形成。

    2000年，FastStartTaqDNA聚合酶

    作為“熱啟動(dòng)PCR”應(yīng)用產(chǎn)品推出(2000)。通過(guò)在其酶混合物（FastStart高保真PCR系統(tǒng)，于2003年推出）中添加FastStartTaqDNA聚合酶，羅氏創(chuàng)建了一個(gè)能夠滿足多重PCR和高保真熱啟動(dòng)PCR等苛刻應(yīng)用的系統(tǒng)。

    以上我們介紹了PCR酶的發(fā)展和歷史。這樣發(fā)展起來(lái)的新型PCR技術(shù)現(xiàn)在不僅應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，還應(yīng)用于醫(yī)療實(shí)踐、食品檢測(cè)和刑事調(diào)查等多個(gè)領(lǐng)域。